Sebelum kita masuk ke bahasan inti dari teori ini. Dari search engine google teknik “kohler illumination” sendiri sudah banyak referensinya dari bahasa inggris. Tapi ya informasinya itu kurang bisa kena ke yang membutuhkan macem pertanyaan “gimana caranya biar dapet gambar atau pengamatan bagus lewat mikroskop”. Karena kalau dari saya sendiri kasusnya begini, cukup banyak kan foto yang ada di internet dari hasi pengamatan mikroskopis, dan semua bagus, tapi di lab susah banget tuh ngedapetin foto sebagus itu. Nah dari situ saya mencari apakah ada teknik khusus suatu teknik pewarnaan atau pengaturan preparat atau apapun itu yang bisa menghasilkan foto sebagus tadi.
Tapi kata kunci teknik penggunaan mikroskop tidak membawa saya ke kohler illumination, yang ada malah dibawa ke teknik pengaturan preparat. Entah kata kunci yang salah atau saya saja yang kurang berbakat dalam googling. Btw, kata kunci yang saya pake itu “how to get good view on wet mount of microscope 1000x”, dapetnya macem macem sih, silahkan kalo mau coba :D.
Balik lagi dalam pengaturan preparat ini SOP yang saya temukan kurang lebih sama dengan yang ada di lab pada umumnya. Misal penggunaan minyak imersi pada perbesaran 1000x tanpa cover glass, preparat kering, preparat basah dan sebagainya. Oiya saya sendiri dasar lab nya adalah mikrobiologi di ITB. Dan selama di sana juga tidak menemukan teknik yang sejenis kohler illumination.
Ada satu sih teknik unik di pengamatan jamur atau lebih tepatnya mikrofungi yang dari cawan petri, teknik ini mencupliknya pake selotip buat ngambil sampelnya. Saya belum nyoba sih, tapi permasalahan pengamatan fungi itu sendiri lebih ke seberapa tipis dan terterawang miseliumnya, kan biasanya numpuk tuh. Ya bagian ini bisa diomongin di pos lain aja. Kita fokus ke “Kohler Illumination”
Sebelum masuk ke teknik atau teori nya itu sendiri, ada baiknya kita lihat lagi teori teori dasar yang ada di pengamatan mikroskop itu sendiri. Disini saya akan menjelaskan dari buku rujukan yang lebih dalam dari “Brock” atau “Cappuccino”, buku masternya anak mikro. (kayaknya lebih dalem sih, ragu juga, IMO). Nah bukunya itu adalah FUNDAMENTALS OF BIOANALYTICAL TECHNIQUES AND INSTRUMENTATION, SECOND EDITION karya GHOSAL, SABARI, AVASTHI, ANUPAMA (googlebooks). Nyari ebooknya susah, kalau ada yang nemu bisa kabari saya wkwkwk. Dari buku ini dijelaskan mulai dari dasar nya optik secara fisika sampai ke teknik, mantaplah.
Pada dasarnya mikroskop itu fungsinya adalah memberikan gambar dari suatu objek ke mata manusia dengan sifat gambar yang diharapkan yakni resolusinya baik dan diperbesar (ukurannya). Demi memenuhi tujuan tersebut ada beberapa parameter yang dibutuhkan : (1) resolusi, (2) kontras, (3) perbesaran (magnification), (4) sensitivitas.
Dari ke 4 parameter ini, yang paling terasa sifat fisisnya atau fenomenanya itu nomer 1 resolusi dan nomer 2 kontras. Kenapa begitu, coba lihat kembali ke teknik pewarnaan dan batasan dari tiap mikroskop dan mata manusia.
Ok sambil jalan…
1. Resolusi
Maksud dari resolusi itu sendiri adalah kemampuan untuk melihat suatu bagian terkecil atau detail dari benda tertentu. Kita ambil contoh pas tes mata, kita diuji dan diukur kemampuan resolsi mata kita untuk melihat huruf dari jarak tertentu. Mata sehat akan bisa membedakan huruf 1 dengan lainnya dengan tepat. Sebaliknya dengan mata rabun, cukup sulit untuk melihat huruf tadi. Nah kita ingat lagi nih pelajaran fisika tentang optik, suatu benda akan membetuk bayangan di sensor penglihatan mata kita setelah melewati bagian bagian mata macam kornea iris lensa dst.
Bayangkan garis digambar itu menjadi bentuk 3D atau 2D seperti yang umunya kita lihat itu. Jadi ada banyak titik yang bergabung jadi garis, membentuk bidang dan objek kemudian ada tekstur dan volume dll. Untuk benda yang normal kita bisa lihat konsep ini sepertinya cukup. Tapi untuk benda yang kecil atau sangat jauh berbeda cerita. Karena ada variabel dari cahaya itu sendiri. Ambil contoh sel, mata manusia tidak mungkin bisa melihat sel tanpa bantuan alat. Karena mata kita tidak bisa memilah atau memfokuskan cahaya yang bersumber (entah pantulan atau tembus) dari objek yang kecil tadi dibanding cahaya disekitar. Nah apabila bisa dipilah contoh lewat lubang kecil bisa jadi kita melihat. Tapi lubang kecil tadi juga alat kan. Coba cek sejarah mikroskop dan fotografi, sejauh yang saya tau disana desain yang digunakan selalu ada tabung entah ada lensanya atau tidak. CMIIW ini cerita semoga gak salah wkwk. kalo ternyata salah ngomong aja bisa diedit :v
Resolusi utamanya ditentukan dari numerical apperture (NA) dari lensa kondenser objectif dan panjang gelombang dari cahaya. Jika panjang gelombang dari cahaya sumber tidak cukup untuk melewati dua titik objek maka dua titik objek ini akan tampak sebagai 1 objek.
kita ambil contoh lain misal mikroskop cahaya dibanding mikroskop elektron. Foton yang ditangkap dari mikroskop cahaya punya rentang panjang gelombang sekitar 550 nm jadinya 2 objek yang jaraknya kurang dari 220 nm akan jadi 1 objek. Kalau mikroskop elektron pastinya lebih kecil lagi kan posisinya diatas sinar UV.
Sebanarnya kalau mau lebih jauh ada perhitungannya mengenai batas dari resolusi suatu alat (limit of resolution). Kalau mau silahkan baca bukunya yang bagian ini open access kog. Takut salah ngomong kalo itungan gini wkwk. Tapi inti dari ini adalah resolusi maksimum dari mikroskop cahaya itu 0,2 mikron atau 200 nm. Jadi kalo lebih kecil misalnya kayak virus itu gak keliahatan.
Oiya mungkin bakal ada yang kepikiran trus kenapa butuh minyak imersi? kalo itu kaitannya sama indeks biasnya minyak imersi mendekati lensa, jadi tidak ada pembiasan (bener gak ini EYD) yang tidak terkontrol, di “cappuccino” atau “brock” ada sih dibuku rujukan buat yang ini juga ada sih. Tapi kalau mau mengingat fisika kembali bisa lihat youtube aja kata kuncinya walter lewin rainbow. Beliau menjelaskan secara asik kenapa bisa terbentuk pelangi dan kaitannya dengan hukum snelius yang ada indeks biasnya tadi.
Jadi sampe sini apakah makin bingung kalo pengamatan ini bakteri bulet apa batang yak ? karena kan jarak kurang dari 200 nm akan kelihatan jadi 1 objek, itulah alasan pewarnaan atau ngebuat preparat atau apusannya harus bagus. ngomongin soal pewarnaan ada kaitannya sama parameter kontras
2. Kontras
Pada intinya kontras adalah perbedaan intensitas atau warna dari dua objek atau antara objek dan background. Untuk mata manusia setidaknya ada nilai kontras 2% beda dengan kamera atau detektor. Simpelnya untuk praktik anak mikro sehari-hari benda yang sangat kecil dan tidak berwarna seperti bakteri akan sangat sulit dilihat kalau dilihat yang muncul adalah backgroundnya. Makanya pewarnaan itu penting ini lebih detailnya tentang pewarnaan ada di “cappuccino” kalo gak salah. Tapi ternyata kontras tidak terbatas di pewarnaan saja.
Ternyata kontras bukan sifat bawaan dari spesimen namun bergantung pada interaksi dari spesimen dengan cahaya dan eisiensi dari sistem optik untuk menunjang penangkapan (record) gambar (informasi) menggunakan detektor. Kontras ini di mikroskop yakni dengan cara mengatur aperture diafragma, tipe spesimen dan detektor optik. Kalau praktiknya di mikroskop itu ada di bagian field aperture, condenser aperture (emang ini ada yak), tambahan macem setting kamera, dan pewarnaan.
Jadi sesuai yang tertulis dibuku memang kontras ini bukan sifat bawaan dari spesimen. Kita ambil contoh ketika memakai mikroskop phase contrast. Mikroskop khusus ini membuat kontras dari manipulasi fasa gelombang sedemikian rupa sehingga background yang didapatkan berbeda dengan gambar objek. Kalau dicari gambarnya antara backgroundnya lebih terang dari objek atau sebaliknya. Mungkin simpelnya kalau dibayangin mekanismenya itu kayak intererensi destruktif dan konstruktif.
3. Perbesaran
Perbesaran adalah pengukuran dari kemampuan dari lensa atau instrumen optik lainnya untuk memperbesar, dan diekspresikan dalam rasio ukuran objek dengan gambar yang dihasilkan (bayangan). Simpelnya seperti yang sudah diketahui 100x 400x 1000x dll
4. Sensitivitas
Intinya seberapa sensiti detektor yang kita punya dalam menangkap sinyal dalam kasus ini foton.
Jadi segitu dulu dasar-dasar optik mikroskop ada lanjutannya sih tapi nanti bisa ditambahin, nah sekarang masuk ke intinya
Kohler Illumination
Secara definisi dari wikipedia, Kohler illumination merupakan metode pencahayaan spesimen untuk mentransmisikan atau merefleksikan cahaya pada mikroskop optis. Tujuan dari teknik ini yakni menyamaratakan pencahayaan pada sampel dan memastikan gambar dari sumber cahaya (lampu) tidak muncul di hasil gambar yang didapatkan. (kaku juga ya penjelasannya mungkin liat gambar biar jelas)
Keterangannya yang ada gambar estetika berwarna itu hasil objeknya, trus gambar garis kayak ilustrasi gelombang itu pencahayaannya.
Jadi yang diinginkan itu gambarnya fokus dan pencahayaannya maksimal. Caranya dengan melakukan pensejajaran (align) kayak yang di bioinformatika, cuman yang di-align itu cahaya (pencahayaan), gambar/banyangan-nya. Kita ingat kembali ilustrasi di atas spesimen atau objek gambar/bayangan-nya secara berurutan terbentuk dari lensa ke lensa hingga ke mata. Sama halnya dengan sumber cahayanya. Namun peletakan atau posisi dari gambar atau cahaya tersebut berbeda.
Kita balik lagi ke materi fisika optik. Kondisi kondisi bayangan lensa cembung.
kita perhatikan pada 2 peristiwa saja, objek di F dan objek di antara F dan 2F.
Ilustrasi dari kohler illumination sebenarnya menunjukkan 2 dasar ini. Lingkaran warna hijau menunjukkan pemetaan objek, kotak warna kuning menunjukkan pencahayaan. Jadi yang terjadi adalah bayangan objek/gambar akan terus diperbesar tiap melewati lensa di mikroskop. Sedangkan sumber cahaya/cahaya akan diteruskan tanpa terbentuk bayangan atau gambar sehingga jika disatukan menjadi gambar yang tampak jelas dengan pencahayaan optimal.
Sekarang kita sudah mengerti apa tujuannya dan fenomena yang sebenarnya terjadi, lalu bagaimana caranya. Kembali ke pensejajaran di kohler illumination, untuk fokus dari gambar objek yang kita atur atau ubah-ubah adalah bagian coarse adjustment knob dan fine adjustment knob serta gerakkan meja objek untuk posisi objeknya (lingkaran biru dan hijau). Pengaturan pencahayaan dilakukan dengan mengecilkan sumber cahaya, menaikkan condenser (khusus kasus gambar di bawah ini, beda mikroskop beda, kayak inverted brarti condensernya di atas diturunin ke bawah CMIIW), memosisikan cahaya yang diteruskan condenser agar fokus dan tepat di tengah jadi bidang yang diatur itu x,y,z (lingkaran ungu dan merah)
biru = coarse / fine adjustment knob (z)
hijau = pengatur posisi meja objek (x,y)
merah = condenser (x,y,z)
ungu = field diafragma [iris]
Kalau pengaturan fokus udah cukup ngerti, sekarang pengaturan pencahayaannya
langkah pertama : kecilkan diafragma hingga tampak bagian sisinya
Bentuk sisi dari cahaya yang diteruskan oleh diafragma dan condenser berbentuk lingkaran atau segi enam. Bentuk ini akan tampak jelas ketika diafragmanya diatur kecil dan pensejajarannya benar di sumbu z.
Hasil pencahayaan yang didapatkan ketika tidak benar pensejajarannya pada sumbu z tampak gambar atau cahaya yang bagian sisinya buram. Kondisi ini akan tampak jelas ketika kita sudah mengecilkan diafragma terlebih dahulu.
langkah kedua : mengatur dengan benar posisi condenser (sumbu z) sehingga pencahayaan tampak tajam
Setelah dilakukan pengaturan pada condesnser dari sumbu z maka pencahayaan akan tampak tajam. Hal ini dikarenakan sumber cahaya berada pada titik fokus lensa (f) di condenser sehingga cahaya tersebar merata (menuju tak hingga) dengan bentuk sesuai lubang pada diafragma.
langkah ketiga : memposisikan cahaya yang sudah fokus ke tengah (sumbu x,y)
Kalau sudah tajam seperti itu, gerakkan condenser ke tengah dalam sumbu x, y. Hal ini mengakibatkan ketika diperbesar kembali diafragmanya akan menghasilkan pencahyaan yang setara ke seluruh sisi gambar (hasil bayangan). Artinya tampak terang di mata kita.
langkah keempat : membuka kembali diafragma seperti kondisi awal
langkah terakhir : mengatur intensitas pencahayaan (iris)
Letak tempat pengaturannya ada dibagian sini.
Begitu caranya Kohler illumination. Mungkin ada yang kepikiran, “selama ini tidak menggunakan teknik ini juga hasilnya sudah bagus ?”. Kalau di mikroskopcahaya memang gak terlalu kelihatan bedanya. Tapi kalau sudah memakai mikroskop yang lain semacam phase contrast, dkk akan sangat berbeda. Dan juga sebagai catatan tiap mengubah lensa objek, kohler illumination -nya juga perlu diatur kembali.
berikut rangkuman cara singkatnya haha.
Keuntungan terbesar dari ilmu ini itu bukan di hasil pengamatan yang makin bagus, tapi kita jadi tau lebih banyak tentang bagian bagian mikroskop, beserta teorinya tentunya. Masih banyak lagi yang bisa kita pelajari dari bagian dan penggunaan mikroskop.
Buat yang pingin belajar lebih lanjut silahkan buka referensi berikut
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/introduction.html
zeiss ini menjelaskan segala seluk beluk mengenai mikroskop mulai dari dasar, hingga teknik lanjut kayak Point-Spread Function (PSD) yang entah apa itu (masih belajar)
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/anatomy/kohler/
kalo olympus ini menjelaskan kohler tapi ada animasi interaktif.
https://www.youtube.com/watch?v=ZRZ9_ov6Fak
ini dari Microcourses paling gampang dicerna dan kalo diikuti channelnya ada juga tuh tentang Point-Spread Function (PSD)
Akhir kata sebenarnya saya sendiri belum nyoba mempraktikan ini, karena udah gak ada akses ke lab atau mikroskop, dan belum ada kesempatan untuk punya akses. Jadi kalau sudah ada yang nyoba bolehlah untuk berbagi ilmunya yang sudah diterapkan.
:::::Unidentified:::::. 